微生物組（又稱(chēng)菌群）測(cè)序在生態(tài)健康診斷、生態(tài)過(guò)程監(jiān)控、生物資源挖掘、合成生物學(xué)研究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。針對(duì)目前菌群測(cè)序方法學(xué)領(lǐng)域面臨的痛點(diǎn)與難點(diǎn)，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所所單細(xì)胞中心和中國(guó)海洋大學(xué)提出一種高物種分辨率、高靈敏性，并可同時(shí)鑒定所有原核與真核微生物、不懼樣品降解或污染的低成本微生物組測(cè)序技術(shù)2bRAD-M。
在微生物組研究中，解析微生物群落的物種構(gòu)成主要依賴(lài)于兩種高通量手段：擴(kuò)增子測(cè)序（16S/18S/ITS）和鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序（WMS）。目前這兩種主流手段都面臨著關(guān)鍵瓶頸。擴(kuò)增子測(cè)序存在擴(kuò)增偏好性、脫靶擴(kuò)增、物種分辨率低等問(wèn)題，且通常無(wú)法同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌、古菌與真菌。鳥(niǎo)槍法測(cè)序雖然一定程度上解決了上述問(wèn)題，但對(duì)樣本DNA質(zhì)和量的要求高，故通常難以分析痕量、高度降解或污染嚴(yán)重的樣品，且測(cè)序成本相對(duì)很高?！?/span>
據(jù)此，青島能源所單細(xì)胞中心博士孫政、黃適等提出了名為2bRAD-M的“簡(jiǎn)化宏基因組測(cè)序技術(shù)”，有效克服了上述擴(kuò)增子測(cè)序和鳥(niǎo)槍法測(cè)序的核心缺陷，可服務(wù)于人體與環(huán)境中痕量、高度降解或污染嚴(yán)重之菌群樣品的高效解析。
IIB型限制性?xún)?nèi)切酶是一種能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，在識(shí)別位點(diǎn)上游和下游的特定距離進(jìn)行切割，形成等長(zhǎng)短片段（20—33 bp）的核酸內(nèi)切酶。作為一種基于IIB型限制性?xún)?nèi)切酶特性的測(cè)序技術(shù)，2bRAD目前已經(jīng)被應(yīng)用于包括人體、模式動(dòng)物、海洋動(dòng)物等上百個(gè)單一物種的基因組研究。但一個(gè)菌群通常由成百上千個(gè)真菌、細(xì)菌和古菌物種組成，比分析單一物種復(fù)雜得多。
2bRAD-M技術(shù)的原理是：處理菌群總DNA樣本，對(duì)IIB酶切片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，然后以各種微生物基因組序列上的理論酶切位點(diǎn)為參造，來(lái)推斷菌群結(jié)構(gòu)。為驗(yàn)證該技術(shù)，科研人員通過(guò)模擬酶切數(shù)據(jù)研究了不同來(lái)源、相似度或復(fù)雜程度以及不同實(shí)驗(yàn)方法學(xué)對(duì)菌群定性和定量分析的影響，并解決了高重復(fù)性短片段DNA干擾序列匹配的問(wèn)題；通過(guò)利用人工和自然菌群樣本，驗(yàn)證了2bRAD-M的敏感性、重復(fù)性、分辨率、準(zhǔn)確度和偏好性等，進(jìn)而挖掘了該方法用于各種實(shí)際菌群樣品之測(cè)序的潛力和局限性。
具體來(lái)說(shuō)，研究證明該技術(shù)能夠有效處理低生物量菌群樣本。例如，針對(duì)總DNA僅為1 pg、長(zhǎng)度僅有50 bp的高度片段化或99%被宿主DNA污染的人工菌群DNA樣本，2bRAD-M均能得到種水平、高度準(zhǔn)確、同時(shí)涵蓋細(xì)菌、古菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)的定性與定量分析結(jié)果。針對(duì)皮膚，腸道和環(huán)境等實(shí)際樣本，2bRAD-M同樣表現(xiàn)出色。針對(duì)臨床最常見(jiàn)、但菌群DNA極為微量且高度降解或污染的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，僅用極微量的FFPE切片樣本（3 cm × 2 μm），2bRAD-M就能捕捉到潛在可服務(wù)宮頸癌診斷的微生物物種標(biāo)識(shí)物。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于腫瘤微生物組、免疫組織微生物組等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究與臨床實(shí)踐，具有方法學(xué)意義。
相關(guān)成果發(fā)表在基因組學(xué)領(lǐng)域期刊Genome Biology上。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)博士后科學(xué)基金、山東省人才工程等支持。
